凝膠完整性:實驗結(jié)束后,首先觀察凝膠是否完整,有無破損、斷裂或脫落現(xiàn)象。若凝膠存在明顯破損,可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)樣品在電泳過程中泄漏或遷移路徑改變,使結(jié)果無法準(zhǔn)確反映樣品真實情況,此時實驗結(jié)果可信度低,需重新實驗。
凝膠透明度:正常情況下,凝膠應(yīng)具有良好的透明度,便于觀察條帶。若凝膠出現(xiàn)渾濁、發(fā)白等情況,可能是凝膠制備過程中存在問題,如試劑不純、聚合不充分等,這會影響條帶清晰度,導(dǎo)致難以準(zhǔn)確分析蛋白質(zhì)分離情況。
溴酚藍(lán)位置:溴酚藍(lán)作為常用指示劑,其遷移位置可作為判斷電泳進程的參考。在常規(guī) SDS-PAGE 電泳中,溴酚藍(lán)在不同濃度凝膠中的遷移速度有一定規(guī)律,例如在 10% - 12% 的聚丙烯酰胺凝膠中,其遷移位置大致相當(dāng)于 3 - 5 kDa 的蛋白質(zhì)。若溴酚藍(lán)遷移至凝膠底部或異常位置,需結(jié)合具體情況分析。若過早到達(dá)底部,可能是電泳時間過長或電壓過高,導(dǎo)致小分子蛋白質(zhì)可能跑出凝膠,影響結(jié)果完整性;若遷移過慢,則可能是電壓過低或凝膠濃度異常。
條帶清晰度:清晰、銳利的蛋白質(zhì)條帶是實驗成功的重要標(biāo)志。若條帶模糊、彌散,可能是由于樣品濃度過高,導(dǎo)致蛋白質(zhì)在凝膠中堆積,無法有效分離;也可能是電泳緩沖液使用不當(dāng)、凝膠聚合不均勻或電泳過程中溫度過高等原因。此外,樣品中存在雜質(zhì)、蛋白質(zhì)降解等情況,也會造成條帶不清晰。
條帶數(shù)量與位置:根據(jù)實驗?zāi)康暮蜆悠奉A(yù)期,判斷條帶數(shù)量和位置是否合理。對于已知成分的樣品,若條帶數(shù)量缺失,可能是某些蛋白質(zhì)未被有效分離或在樣品處理過程中丟失;若出現(xiàn)額外條帶,可能是樣品污染、蛋白質(zhì)發(fā)生修飾或降解產(chǎn)生新的片段。通過與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量 Marker 對比條帶位置,可估算目標(biāo)蛋白質(zhì)的分子量,若估算值與預(yù)期值偏差較大,需檢查實驗過程是否存在問題。
條帶強度:條帶的強度(顏色深淺)在一定程度上反映了蛋白質(zhì)的含量。同一樣品不同泳道中,若條帶強度差異明顯,可能是上樣量不一致導(dǎo)致;對于不同樣品的條帶,強度對比可初步反映蛋白質(zhì)表達(dá)量的差異,但需注意,條帶強度還受染色效果、曝光時間等因素影響,因此如需準(zhǔn)確分析蛋白質(zhì)含量,還需結(jié)合定量方法進一步驗證。
標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量 Marker:實驗中通常會加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量 Marker 作為參照,其包含一系列已知分子量的蛋白質(zhì)條帶。通過將樣品條帶與 Marker 條帶對比,可準(zhǔn)確判斷樣品中蛋白質(zhì)的分子量范圍,評估電泳分離效果。若 Marker 條帶分離異常,如條帶扭曲、重疊,可能是凝膠質(zhì)量問題或電泳條件不合適,此時基于 Marker 得出的樣品分子量判斷也會不準(zhǔn)確。
陽性與陰性對照:在設(shè)計實驗時,設(shè)置陽性和陰性對照有助于判斷實驗結(jié)果的可靠性。陽性對照應(yīng)出現(xiàn)預(yù)期的蛋白質(zhì)條帶,若未出現(xiàn),則可能是實驗操作過程存在問題,如樣品處理不當(dāng)、電泳條件不合適等;陰性對照應(yīng)無目標(biāo)條帶,若出現(xiàn)條帶,則提示可能存在樣品污染或非特異性反應(yīng),需要對實驗過程進行排查和優(yōu)化。